一、紫外分光光度法测定蛋白质浓度
[目的]:掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理，熟悉紫外分光光度计的使用。
[原理] :
蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测定的依据，但由于各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，故要准确定量，必需要有待测蛋白质的纯品作为标准来比较，或且已经知道其消光系数作为参考。另外，不少杂质在280nm波长下也有—定吸收能力，可能发生干扰。其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶碱)的影响更为严重。然而核酸的最大吸收峰是在260nm。因此溶液中同时存在核酸时，必须同时测定OD260nm，与OD280nm。，然后根据两种波长的吸收度的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量。
本法操作简便迅速，且不消耗样品(可以回收)，多用于纯化之蛋白质的微量测定。主要缺点：当待测的蛋白质与标准蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量差异较大时，则产生—定误差，混有核酸时必须分别测定280nm和260nm两处的OD值，再按公式推算蛋白质含量。
[操作]
取试管7支，按下表操作：
|
试剂 |
标准管 |
测定管 |
空白管 |
||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|||
|
稀释标准蛋白液（ml） |
0.5 |
1.0 |
1.5 |
2.0 |
2.5 |
0 |
0 |
|
稀释样本蛋白质（ml） |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1.0 |
0 |
|
生理盐水（ml） |
3.5 |
3.0 |
2.5 |
2.0 |
1.5 |
3.0 |
4 |
各管混匀，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以空白管调节零点，分别于280nm、260nm波长下测定各管光密度。
[计算]
(一) 直接根据标准液与待测液的光密度值(OD280nm)，或从标准曲线，求得样本蛋白质含量。以标准管各管光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线，然后根据测定管光密度值，直接查标准曲线求得样本中蛋白质的含量。
1．选一种与待测样本蛋白质氨基酸组成相近似的蛋白质纯品，用生理盐水稀释至浓度为 lmg／m1，作为稀释标准蛋白质溶液。
2．用生理盐水稀释待测样本蛋白质至浓度约为lmg／m1，即为稀释样本蛋白质溶液。
(二)利用经验公式直接计算样本蛋白质含量，
准确吸取血清样本0.1ml，置于50ml容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度，即500倍稀释，在280nm和260nm两处波长分别测得光密度值、再按下列公式计算。
1、OD280／0D260＜1.5时，用Lowry-Kalokar公式：
样本蛋白质含量(mg／ml)＝1.45OD280一0.74OD260
2、OD280／OD260﹥1.5时，用Lamber-Beer定律计算：
样本蛋白质含量(mg／m1) = OD280／K×L＝（OD280／6.3×1）×10g／L
本实验样品：牛血清白蛋白E1%cm＝6.3（100ml／cm.g）
K：克分子消光系数；E1%cm：百分比吸光度的吸光系数；
注：不同蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量有差异，故标准管与测定管的蛋白质氨基酸组成应相似，以减小误差。
[器材]
(一) UV-9200紫外分光光度计
(二) 50ml容量瓶
[试剂]
(一) 生理盐水
(二) 血清蛋白(人或牛)纯晶
(三) 待测样本蛋白质：蛋白质样品用生理盐水稀释而成。
二、紫外吸收法测定蛋白质含量
（一）原 理
蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸等残基，它们的结构中具有共轭双键，对紫外光有吸收作用，其最大值在280nm波长处。在此波长附近，蛋白质溶液的光吸收值与其含量（范围是0.1~1.0mg/ml）成正比，因此，280nm的吸光度可用作蛋白质的定量测定。若将已知不同浓度的蛋白质标准溶液在280nm处测定，并作标准曲线，即可求得未知溶液的蛋白质浓度。此法测定迅速，用量较少，而且不消耗样品和试剂。但若样品中含有其他在280nm吸收的物质，如嘌呤嘧啶等化合物时，就有干扰作用。
（二）试剂及器材
（1）标准蛋白质溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清白蛋白，配制成浓度为1mg/ml的溶液。
（2）待测蛋白质溶液：浓度为1mg/ml左右的蛋白质溶液。
（三）操作
1. 280nm的光吸收法
（1）标准曲线的绘制：取8支试管，编号后按下表加入试剂。
|
管号 试剂(ml) |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
|
标准蛋白质溶液 |
0 |
0.5 |
1.0 |
1.5 |
2.0 |
2.5 |
3.0 |
4.0 |
|
蒸馏水 |
4 |
3.5 |
3.0 |
2.5 |
2.0 |
1.5 |
1.0 |
0 |
|
蛋白质浓度（mg/ml） |
0 |
0.125 |
0.25 |
0.375 |
0.50 |
0.625 |
0.75 |
1.0 |
|
OD280 |
|
|
|
|
|
|
|
|
混匀，选用光程为1cm的石英比色杯，在紫外分光光度计280nm波长处以0号管调“零”分别测定各管溶液的光密度（OD280）。以纵坐标为光密度值，横坐标为蛋白质浓度绘出标准曲线。
（2）样品测定：取待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，混匀，按上述方法测定280nm波长处的光密度值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。
2．280nm和260nm的吸收差法
将待测的蛋白质溶液稀释到光密度在0.2~2.0之间，在波长280nm和260nm处以相应的溶液作空白对照，分别测得待测样品的光密度值（OD280和OD260）。应用280nm和260nm的吸收差法经验公式直接计算出蛋白质浓度。
公式：蛋白质浓度（mg/ml）=1.45 OD280－0.74 OD260
三、Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度
[目的]
掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理。
[原理]
蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。
[操作]
取试管7支、编号、按下表操作：
|
试剂 |
管号 |
|||||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
空白管 |
测定管 |
||||
|
蛋白质标准液（ml） |
0.2 |
0.4 |
0.6 |
0.8 |
1.0 |
|
|
|||
|
双蒸水（ml） |
0.8 |
0.6 |
0.4 |
0.2 |
0 |
1.0 |
|
|||
|
待测样品（ml） |
|
|
|
|
|
|
1.0 |
|||
|
试剂甲（ml） |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
|||
|
混匀后，置于20-25℃水浴保温10min |
||||||||||
|
试剂乙（ml） |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
|||
立即混匀，在20℃～25℃水浴保温30分钟。用660nm比色，测定光密度值。
操作注意事项：
1．按顺序添加试剂
2．试剂乙在酸性条件下稳定，碱性条件下（试剂甲）易被破坏，因此加试剂乙后要立即混匀，加一管混匀一管，使试剂乙（磷目酸）在破坏前即被还原。
[计算]
(一)绘制标准曲线。以浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。
(二)以测定管光密度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g／L)。
(三)再从标准管中选择—管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g／L)。
[器材]
(一)721型分光光度计
(二)恒温水浴箱
(三)中试管7支
(四)刻度吸管：1. 0ml二支；0.5ml一支；5.0ml一支。
[试剂]
(一)试剂甲
(1)4％碳酸钠(Na2CO3)溶液
(2)0.2N氢氧化钠溶液
(3)1％硫酸铜溶液(CuSO4·5H2O)
(4)2％酒石酸钾钠溶液(或酒石酸钾或钠)
在使用前(1)与(2)、(3)与(4)等体积混合，再将两混合液按50：1比例混合，即为试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。
(二)试剂乙：
(1)市售酚试剂在使用前用NaOH滴定，以酚肽为指标剂，根据试剂酸度将其稀释，使最后酸度为1N。
(2)或取Na2WoO42H2O l00g和Na2MOO3 25g。溶于蒸馏水700ml中，再加85％ H3PO4 50ml和HCl(浓)100ml，将上物混合后，置1000ml圆底烧瓶中温和地回流十小时，再加硫酸锂(Li2SO4H2O)150g，水50ml及溴水数滴。继续沸腾15分钟后以除去剩余的溴，冷却后稀释至1000ml然后过滤，溶液应呈黄色或金黄色(如带绿色者不能用)，置于棕色瓶中保存，使用时用标准NaOH滴定，以酚酞为指示剂，而后稀释约一倍，使最后酸度为1N。
(三)标准蛋白质溶液
用牛血清白蛋白，根据其纯度用蒸馏水配制成0.25mg／ml的蛋白质溶液。(纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定)。
(四)待测样品：准确取血清0.1ml，置于50ml容量瓶中，再加0.9％NaCl溶液至刻度，充分混匀，也可以用尿液为样品。
四、双缩脲法测定蛋白质含量
实验目的：
1.掌握分光光度计的使用方法。
2.掌握标准管法测物质含量的方法。
3.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法。
一、原理：
双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色络合物，此反应即为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。
蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫红色化合物。其颜色深浅与蛋白质的浓度 成正比，可以用比色法进行测定。双缩脲法最常用于需要快速但并不需要十分精确的测定。
二、试剂和器材
试剂:
(1) 标准蛋白溶液（5mg/ml）:准确称取已定氮的酪蛋白(干酪素或牛血清白蛋白)用0．05mol/L氢氧化钠溶液配制，冰箱存放备用。
(2) 双缩脲试剂:溶解1.5g硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0g酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）于500ml蒸馏水中，在搅拌下加入300ml10％氢氧化钠溶液，用水稀释到1000ml，贮存于内壁涂以石蜡的瓶内。此试剂可长期保存。
(3) 样品血清:动物血清用水稀释10倍，置于冰箱保存备用。标准曲线法所用的血清需20倍稀释。
器材:分析天平、分光光度计、 恒温水浴箱、 试管、 吸量管等
三、操作方法：
1.取三支试管按下表操作
|
试管号 |
空白管 |
标准管 |
测定管 |
|
血清（mL） |
0 |
0 |
1.0 |
|
标准蛋白（mL） |
0 |
1.0 |
0 |
|
蒸馏水（mL） |
2.0 |
1.0 |
1.0 |
|
双缩脲试剂（mL） |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
2、摇匀，37℃水浴20min后用分光光度计于540nm波长处比色，以空白管调零点，测得各管吸光度。
3、计算：血清总蛋白质(g／100ml）＝A测/A标×0.005×100/0.1
五、考马斯（Comessie)亮兰结合法测定蛋白质浓度
考马斯亮兰结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法。本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。
【原理】
考马斯亮兰能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性，考马斯亮兰G-250 的最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。考马斯亮兰G250-蛋白质定量测定的高敏性度。
在一定范围内，考马斯亮兰G250-蛋白质复合物呈青色。在595nm下，光密度与蛋白质 含量呈线性关系。故可以用于蛋白质含量的测定。
【操作】(常量法)
(一)标准曲线制备：
配制lmg／ml的标准蛋白溶液。制备系列稀释液，其浓度分别为1000μg／ml，500μg／ml， 250μg／ml，125μg／ml ，62.5μg／ml和31.25μg／ml。
按下表操作：
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
|
标准样品（ml） |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
|
|
|
生理盐水（ml） |
|
|
|
|
|
|
0.1 |
|
染液（ml） |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
摇匀，室温静置3分钟。在第一管为对照管，在721型分光光度计于波长595nm处比色-读取光密度。以各管光密度为纵座标，各标准样品浓度(μg／ml)作为横座标作图得标准曲线。
(二)未知样品测定：
取血清0.25ml直接置于50ml容量瓶中，加生理盐水至刻度，摇匀。(此法样品稀释200倍)。
取试管二只，按下表操作：
|
|
测定管 |
对照管 |
|
稀释样品（ml） |
0.1 |
|
|
生理盐水（ml） |
|
0.1 |
|
染液（ml） |
5 |
5 |
摇匀，静置3分钟，在721型分光光度计亡波长595nm比色，读取光密度，查标准曲线，求得稀释样品蛋白质浓度。
【计算】 未知样品蛋白质浓度μg／ml＝稀释样品浓度×稀释倍数
【优缺点】
(—)操作简便、快速；检测灵敏；重复性好。
(二)显色迅速。约于2分钟内完成染料与蛋白质的结合。所现颜色至少在l小时内是稳定的。
(三)与改良Lowry氏法相比，干扰物质较少。
(四)当样品中存在较大量的十二烷磺酸钠(SDS)、TritonX-100等去垢剂时，显色反应会受到干扰。如样品缓冲液呈强碱性时也会影响显色，故必须预先处理样品。
(五)考马斯亮兰G250染液不宜久存，以1-2月为宜。
(六)微量法测定蛋白含量范围为1-10μg；常量法测以检测范围10-100／μg为宜。
【器材】
(一) 试管l0支
(二) 吸管10ml、l5ml、lml、O.1ml各1支。
(三) 721分光光度法，普通比色杯4只。
【试剂】
(一)O.9％NaCl
(二)待测血清
(三)标准血清
(四)染液：考马斯亮兰G250 0.1克溶于0.5 m1 95%乙醇。再加入100m1 85％(W／V)磷酸。然后加蒸馏水定容到1000ml。[此时溶液为0.0l％考马斯亮兰G250／4.7％(W／V)／乙醇／8.5%(W／V)磷酸]。
六、BCA法测定蛋白质浓度
【目的】：掌握BCA法测定蛋白质浓度的原理。
【原理】：
BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
【操作】
标准曲线的绘制：取试管七支、编号，按下表操作：
|
试剂 |
管号 |
||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
空白管 |
测定管 |
|
|
蛋白质标准液（ml） （1.5mg/ml） |
20 |
40 |
60 |
80 |
100 |
|
|
|
双蒸水（ml） |
80 |
60 |
40 |
20 |
0 |
100 |
|
|
待测样品（ml） |
|
|
|
|
|
|
100 |
|
BCA工作液（ml） |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
|
混匀后，37℃保温30min，用562nm比色，测定吸光度值 |
|||||||
【计算】
（一）绘制标准曲线。
（二）以测定管吸光度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。
（三） 再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。
【优缺点】
(一) 操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的Lowary法快4倍且更加方便；
(二) 准确灵敏，试剂稳定性好，BCA试剂的蛋白质测定范围是20-200μg/ml，微量BCA测定范围在0.5-10μg/ml。
(三) 经济实用，除试管外，测定可在微板孔中就进行，大大节约样品和试剂用量；
(四) 抗试剂干扰能力比较强，如去垢剂，尿素等均无影响
【器材】
（一） 7220型分光光度计
（二） 恒温水浴箱
（三） 中试管7支
（四） 枪式移液管
【试剂】
1、试剂A：1％BCA二钠盐
2％无水碳酸钠
0.16%酒石酸钠
0.4％氢氧化钠
0.95％碳酸氢钠
混合调PH值至11.25。
2、试剂B：4％硫酸铜。
3、BCA工作液：试剂A 100ml ＋ 试剂B 2ml混合。
4、蛋白质标准液：用结晶牛血清白蛋白根据其纯度用生理盐水配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液。（纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定）
5、待测样品：用双缩脲测定法的样品稀释而成。
此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工作者广泛选用。目前BCA法的试剂盒市面有售。总之，虽然蛋白质含量的测定方法很多，但是，还没有一个完美的方法。在选择测定方法时，可根据实验要求和实验室条件决定。
